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FRL'obiettivo obiettivo NA ha spiegato: perché NA 0.8 non significa una collezione di luce dell'80 %
Perché una lente oggettiva con NA 0.8 raccoglie meno del 50% della luce?
Comprendere la vera relazione tra apertura numerica ed efficienza della raccolta
Spesso ci si aspetta che un obiettivo del microscopio ad alto livello NA raccolga una grande frazione della luce disponibile.
Quindi quando un obiettivo è specificato con:
NA = 0,8
Può sembrare intuitivo aspettarsi che raccolga qualcosa vicino all'80 % della luce emessa.
In pratica, tuttavia, la potenza ottica che raggiunge il rilevatore può essere facilmenteMeno del 50% della luce incidente o emessa, E in alcuni esperimenti di fluorescenza la frazione rilevata finale può essere molto più bassa.
Ciò non significa che la specifica NA sia sbagliata.
L'equivoco nasce dal trattareApertura numerica come percentuale di efficienza.
Non lo è.
L'apertura numerica descrive l'accettazione angolare di un sistema ottico. Il throughput ottico effettivo dipende da diversi fattori aggiuntivi, tra cui:
L'angolo solido della collezione
Aberrazione sferica indotta dalla copertura
Perdite di trasmissione all'interno dell'obiettivo
Queste perdite spesso non sono evidenti dalla specifica NA del titolo.
1. Che cosa significa in realtà NA = 0.8?
L'apertura numerica di un obiettivo è definita come:
NA = n · sinθ
Dove:
nÈ l'indice di rifrazione del mezzo tra l'esemplare e l'obiettivo
ThetaÈ il massimo semiangolo di luce che può entrare o uscire dall'obiettivo
Per un obiettivo secco in aria:
N ≈ 1
Pertanto, per:
NA = 0,8
Abbiamo:
Sinθ = 0,8
Che corrisponde a:
Θ ≈ 53 °.
Ma questo ci dice solo che l'obiettivo può accettare raggi entro circa un53 ° mezzo angolo.
Lo faNonSignifica che l'obiettivo raccoglie l'80 % della luce disponibile.
Questa distinzione è fondamentale.
2. Perché NA 0.8 non significa un'efficienza di raccolta dell'80 %
Si consideri una sorgente puntiforme isotropica, come una molecola fluorescente.
Un emettitore isotropico irradia la luce uniformemente in una sfera piena:
Steradianti 4π
Un obiettivo raccoglie solo la frazione di questa sfera che rientra nel suo cono di accettazione.
Per un mezzo angolo di accettazione θ, l'angolo solido raccolto è:
Ω = 2π(1 − cosθ)
La frazione di emissione isotropica totale raccolta è quindi:
La raccolta = Ω / 4π
Oppure:
Ηraccolta = (1 − cosθ) / 2
Per:
Θ ≈ 53 °
La frazione teorica di raccolta è approssimativamente:
20%
Per l'emissione isotropica.
Quindi, anche prima di considerare le perdite di trasmissione:
Un obiettivo secco NA 0.8 non raccoglie l'80 % della luce emessa isotropicamente. La sua frazione di raccolta geometrica è solo del 20% circa.
Questa è puramente una conseguenza della geometria dell'angolo solido.
L'apertura numerica e l'efficienza di raccolta sono quindi correlate, ma non sono linearmente proporzionali.
3. La prima perdita importante: aberrazione sferica indotta dalla copertura
Gli obiettivi High-NA sono particolarmente sensibili alle proprietà ottiche del coverslip.
Un comune coverslip al microscopio è:
#1.5
Con uno spessore nominale di circa:
0,17mm
Tuttavia, i coprioggetti reali hanno tolleranze di produzione.
Il materiale di origine rileva che variazioni di spessore di circa:
± 0,02mm
Sono comuni.
A bassa NA, questo potrebbe non essere un grosso problema.
Ad alta NA, può diventare estremamente importante.
4. Perché lo spessore della copertura è così importante?
Un obiettivo NA alto raccoglie i raggi su un'ampia gamma angolare.
I raggi parassiali viaggiano vicino all'asse ottico.
I raggi marginali entrano nel sistema ottico ad angoli molto più grandi.
Quando questi raggi passano attraverso un coverslip il cui spessore differisce dal valore di progettazione, sperimentano diverse lunghezze del percorso ottico.
Il risultato èAberrazione sferica.
Invece di tutti i raggi che convergono allo stesso punto focale:
I raggi centrali si concentrano in una posizione
I raggi ad alto angolo si concentrano su un altro
Ciò riduce l'intensità fornita nell'immagine o nella regione di rilevamento desiderata.
L'effetto può diventare sorprendentemente grande.
5. Un errore di copertura di 0,02mm può causare una perdita di intensità maggiore
La fonte cita i dati di microscopia per un approssimativamenteObiettivo secco NA 0,85.
Con un errore di spessore coverslip di:
0,02mm
L'intensità che raggiunge il rilevatore può diminuire fino a:
57%
Anche un errore di spessore di solo:
0,01mm
Può causare una perdita di intensità di circa:
19%.
Questo è il motivo per cui la microscopia ad alta NA è molto più sensibile allo spessore del coverslip di quanto molti utenti si aspettino.
Il numero:
0.17
Stampato su molti obiettivi del microscopio non è decorativo.
Indica che l'obiettivo è stato progettato e corretto per uno spessore di copertura di circa:
0,17mm
Operare in modo significativo lontano da questo valore può degradare la correzione ottica.
6. La seconda perdita maggiore: la riflessione di Fresnel all'interno dell'obiettivo
Un obiettivo ad alta NA non è una singola lente.
È tipicamente un complesso assemblaggio ottico contenente molti singoli elementi della lente.
La fonte osserva che un obiettivo NA alto può contenere approssimativamente:
8-12 elementi dell'obiettivo.
Ogni interfaccia ottica introduce qualche riflessione.
Ad incidenza normale, un'interfaccia aria-vetro non rivestita con un indice di rifrazione attorno a:
N ≈ 1.5
Può riflettere approssimativamente:
4%
Della potenza ottica incidente.
Un singolo obiettivo ha due superfici, quindi più obiettivi creano molte interfacce.
7. Le piccole perdite di riflessione si moltiplicano rapidamente
Considera un sistema ottico con otto elementi dell'obiettivo.
Ciò fornisce approssimativamente:
16 interfacce aria-vetro
Se ogni interfaccia trasmessa approssimativamente:
96%
Allora la trasmissione semplificata sarebbe:
T ≈ 0,96 ¹,
Che è approssimativamente:
52%.
Gli obiettivi reali del microscopio utilizzano rivestimenti antiriflesso, quindi le prestazioni effettive dipendono fortemente dal design del rivestimento e dalla lunghezza d'onda.
Tuttavia, il calcolo illustra un principio importante:
Una piccola percentuale di perdita su ciascuna superficie ottica può accumularsi in una grande perdita di trasmissione totale in un obiettivo multi-elemento.
Ulteriori perdite possono provenire da:
Assorbimento in vetro ottico
Interfacce cementate
Aperture interne
Risposta spettrale del rivestimento
La fonte descrive la trasmissione oggettiva pratica come potenzialmente caduta nelIntervallo del 50-70%A seconda del sistema ottico.
8. I raggi ad alto angolo possono sperimentare più riflessione
La situazione diventa più complicata per gli obiettivi di alta NA.
I raggi marginali non colpiscono ogni superficie ottica ad incidenza normale.
Per un sistema NA 0.8, i raggi ad alto angolo possono incontrare interfacce ad angoli superiori approssimativamente:
40°
Parti interne del sistema ottico.
La riflessione di Fresnel dipende da:
Angolo dell'incidente
Polarizzazione
Indici di rifrazione
In particolare, la riflettività diLuce S-polarizzataGeneralmente aumenta con l'angolo incidente.
Pertanto, la semplice stima dell'incidenza normale del 4% può sottostimare le perdite per alcuni raggi ad alto angolo se i rivestimenti non sono ottimizzati per la relativa distribuzione angolare.
Questo è un altro motivo per cui NA teorico e il throughput ottico reale non dovrebbero essere trattati come equivalenti.
9. Mettere insieme le tre perdite
Consideriamo ora un esperimento di imaging a fluorescenza rappresentativo.
La fonte fornisce il seguente budget semplificato:
Fase 1: collezione geometrica
Per l'emissione isotropica:
NA = 0,8 → circa il 20% raccolto.
Fase 2: errore di copertura dello slittamento
Assumere un errore di spessore coverslip di:
0,02mm
E una perdita di intensità di circa:
57%
Frazione rimanente:
20% × 0.43 ≈ 8.6%
Fase 3: perdite obiettive interne
Assumere approssimativamente:
Perdita aggiuntiva del 40%
Attraverso il sistema ottico multi-elemento.
Frazione rimanente:
8.6% × 0.60 ≈ 5.2%
La frazione rilevata risultante è quindi solo intorno a:
5%
In questo esempio illustrativo.
Ciò non significa che ogni obiettivo NA 0.8 abbia un'efficienza del 5%.
Piuttosto, illustra perché vedere meno del 50% di throughput non è sorprendente una volta considerato il sistema ottico completo.
10. NA è un limite geometrico, non una specificazione di efficienza
Questo è il punto concettuale centrale.
L'apertura numerica di un obiettivo descrive:
Il cono angolare massimo accettato dall'obiettivo
Non descrive direttamente:
La percentuale di potenza ottica erogata al rilevatore
La potenza finale rilevata dipende da:
Geometria delle emissioni × raccolta angolo solido × aberrazioni × trasmissione ottica × geometria del rivelatore
Quindi la relazione corretta è più vicina a:
Rilevato Potenza = Potenza Emessa × Raccolta Geometrica × Trasmissione Ottica × Efficienza del Sistema
Non:
Rilevato Potenza ≈ Ingresso Potenza × NA
Questa distinzione elimina una grande quantità di confusione quando si valutano sistemi ottici ad alta NA.
11. Raccomandazione pratica 1: Controllo dello spessore della copertura
Per obiettivi a secco ad alto NA, lo spessore del coverslip deve essere trattato come un parametro ottico, non solo una specifica meccanica.
La fonte raccomanda che per gli obiettivi con:
NA > 0.7
Lo spessore del coverslip dovrebbe idealmente essere controllato all'interno approssimativamente:
± 0,005mm
Quando è richiesta la massima prestazione ottica.
Per esperimenti impegnativi:
Utilizzare coprioggetti calibrati
Controllare lo spessore del coverslip specificato dell'obiettivo
Evita di presumere che tutti i coverslip #1.5 siano otticamente identici
Obiettivi dotati di unCollare di correzioneA volte può compensare la variazione dello spessore di coverslip su un intervallo limitato.
12. Raccomandazione pratica 2: abbinare il mezzo di immersione
Per gli obiettivi di immersione dell'olio, l'indice di rifrazione dell'olio di immersione fa parte del design ottico.
La fonte fornisce un tipico indice di rifrazione del design di circa:
N = 1.515.
Se l'olio di immersione ha un indice di rifrazione significativamente diverso, i raggi ad alto angolo possono sperimentare un'ulteriore discrepanza dell'indice di rifrazione.
Ciò introduce aberrazioni simili in linea di principio a quelle causate da uno spessore di copertura errato.
Pertanto, per obiettivi di petrolio ad alto contenuto di NA:
Utilizzare l'olio di immersione specificato per l'obiettivo piuttosto che trattare tutti gli oli di immersione come equivalenti.
La temperatura può anche influenzare l'indice di rifrazione, quindi la microscopia ad alta precisione può richiedere anche la consapevolezza della temperatura.
13. Raccomandazione pratica 3: non massimizzare sempre il condensatore NA
Nella microscopia a luce trasmessa, l'illuminazione massima NA non è sempre desiderabile.
La sorgente rileva che il condensatore NA è comunemente impostato su approssimativamente:
70-90% dell'obiettivo NA.
Questo riduce intenzionalmente un po 'di throughput leggero.
Perché?
Perché la microscopia comporta un compromesso tra:
Risoluzione
Contrasto
Profondità di campo
Uniformità di illuminazione
Trasmettitore ottico
Ridurre leggermente l'apertura del condensatore può migliorare il contrasto anche se riduce la quantità di luce che entra nell'obiettivo.
Questa è quindi una regolazione ottica intenzionale, non un guasto di efficienza.
14. Non utilizzare NA come percentuale
Una regola utile è:
Non interpretare mai NA numericamente come la percentuale di luce raccolta.
Ad esempio:
NA = 0,8 prima collezione 80%
Per l'emissione isotropica nell'aria, la corrispondente raccolta geometrica teorica è più vicina a:
~20%
Prima di considerare altre perdite ottiche.
La differenza deriva dal fatto che la raccolta della luce è governata daGeometria ad angolo solido, Non da una semplice percentuale lineare.
Questo diventa ancora più importante quando si confrontano gli obiettivi.
Ad esempio, aumentare NA da 0,4 a 0,8 non significa semplicemente:
40% → 80% di efficienza
Le relazioni angolari sottostanti e angolo solido non sono lineari.
15. Cosa dovresti controllare quando l'efficienza della raccolta è troppo bassa?
Se un obiettivo ad alta NA fornisce meno potenza ottica del previsto, controllare sistematicamente il sistema ottico.
1. Conferma ciò che NA rappresenta effettivamente
Calcolare l'angolo di accettazione e, se del caso, la corrispondente frazione di raccolta dell'angolo solido.
2. controllare lo spessore coverslip
Per obiettivi ad alto NA, anche errori di piccolo spessore possono introdurre un'aberrazione sferica significativa.
3. Verificare l'indice di rifrazione medio-immersione
Per gli obiettivi di immersione, il mezzo ottico deve corrispondere alla progettazione dell'obiettivo.
4. Controllare la trasmissione dipendente dalla lunghezza d'onda
I rivestimenti antiriflesso e la trasmissione del vetro variano con la lunghezza d'onda.
Un obiettivo ottimizzato per la gamma visibile può avere un throughput molto diverso nel near-UV o near-IR.
5. Valutare la catena ottica completa
Il segnale finale del rilevatore può anche essere ridotto di:
Filtri
Specchi dicroici
Splitter a fascio
Lenti a tubo
Accoppiamento in fibra
Determinare quante volte
L'obiettivo è solo un elemento nella catena di misurazione.
16. Conclusione
Un obiettivo specificato con:
NA = 0,8
Non garantisce che l'80 % della luce disponibile raggiungerà il rilevatore.
L'apertura numerica è definita da:
NA = n · sinθ
E descrive l'accettazione angolare dell'obiettivo.
Per un obiettivo a secco NA 0.8, il mezzo angolo massimo è approssimativamente:
53°
Per un emettitore isotropico, ciò corrisponde solo a circa20% della piena sfera di emissione 4π.
Da lì, possono derivare ulteriori perdite da:
Aberrazione sferica indotta dalla copertura
Riflessione di Fresnel
Trasmissione ottica multi-elemento
Comportamento dei raggi ad alto angolo
Non corrispondenza dell'indice di rifrazione
Il resto del percorso ottico di rilevamento
La lezione di ingegneria più importante è quindi:
L'apertura numerica è un parametro di accettazione geometrica, non una percentuale di efficienza di raccolta.
Se la potenza raccolta è inferiore al previsto, non concludere immediatamente che l'obiettivo è difettoso.
Invece, valuta l'intero budget ottico:
>> → > → → > > > → > > >
Una volta considerati questi fattori, un obiettivo con NA 0.8 che fornisce meno del 50% della luce disponibile non è necessariamente sorprendente.
La luce mancante spesso non manca affatto.
Semplicemente non era mai all'interno del cono ottico utilizzabile-o è stato perso da qualche parte lungo il percorso ottico.